你竟然不知道质谱可以做蛋白验证(转自美吉生物微信公众号)

  • 2017-11-13 10:22:38
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概要:Western Blot折磨的你可以试试这个技术

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在上一篇微信推送新技能get:如何用蛋白组学的手段来研究microRNA我们给大家介绍了一个做研究的经典套路:表型(疾病)→找差异蛋白(基因)→验证。找差异蛋白我们可以用相对定量蛋白组学技术iTRAQlabel free),但是后续的验证工作其实并不好做,特别是用western blot来验证蛋白的表达量涉及到是否有商业化抗体,没有的话还得做抗体,有抗体还有抗体好不好用的问题,就算抗体好用你能不能跑出漂亮的条带也是个技术活,总之就是不好做。其实在那篇推送文末我们给大家指出了一个新路子,就是可以用质谱技术来做蛋白验证啊,今天小编就为大家来介绍一下:绝对定量蛋白组技术,Parallel reaction monitoringPRM


PRM是什么?


PRM(平行反应监测,Parallel Reaction Monitoring))是一种基于高分辨、高精度质谱的离子监视技术,能够对目标蛋白质、目标肽段(如发生翻译后修饰的肽段)进行选择性检测,从而实现对目标蛋白质/肽段进行绝对定量。PRM 技术基于高分辨、高精度质谱(如Orbitrap系列),首先利用四级杆质量分析器的选择能力,用Q1选择目标肽段的母离子;随后在collision cell中对母离子进行碎裂;最后利用高分辨、高质量精度分析器在二级质谱中检测所选择的母离子窗口内的所有碎片的信息。这样即可对复杂样本中的目标蛋白质/肽段进行准确地特异性分析。

相比于传统SRM/MRM只检测目标离子对的模式, PRM技术将采集二级信息所用的四级杆质量分析器替换为更高分辨、更高质量精度的分析器,实现了从目标离子对检测到全部目标离子碎片检测的转化。因此,PRM技术不仅具有SRM/MRM的靶向定量分析能力,还同时具备了定性能力。其在定量分析中的优势还体现在:(1)质量精度达到ppm级,能够比SRM/MRM更好地排除背景干扰和假阳性,有效提高复杂背景下的检测限和灵敏度;(2)对子离子进行全扫描,无需选择离子对和优化碎裂能量,更容易进行方法学建立;(3)更宽的线性范围:增加至5-6个数量级。

一张图了解PRM


PRM项目是怎么做的

蛋白提取:

    第一步,从样品中提取蛋白;

    第二步,用Brandford法或BCA法定量蛋白质浓度;

    第三步,蛋白质样品SDS-PAGE分析并评价样品质量是否符合后续实验要求;

可行性分析

    第一步,对质量达标的蛋白样品进行还原烷基化处理;

    第二步,每个样品取等量蛋白Trypsin酶解脱盐后上机检测进行蛋白鉴定,确认目标蛋白的目标肽段;

方法学建立:

    第一步,合成目标多肽;

    第二步,建立标曲;

PRM检测:

    第一步,取等量蛋白溶液进行还原烷基化处理;

    第二步,Trypsin酶解脱盐;

    第三步,肽段定量;

    第四步,根据肽段定量结果进行将样本进行液相串联质谱(LC-MS/MS)分析;

采用Skyline软件进行定量分析

PRM实验流程图

注:以上实验步骤为本公司PRM项目操作实验步骤


关于PRM你需要知道的


1。可行性分析是必须的。因为不是每一个在iTRAQ中鉴定到的差异蛋白都可以在PRM中鉴定到。

2.挑选特异性肽段是个技术活,不是随便一条特异性肽段都能用于定量。

3.合成同位素肽段定量比合成普通肽段定量准确性要高,当然合成费用也更贵。

4. PRM可以做相对定量吗,答案是:当然可以。这样就不需要合成肽段用于表曲建立了。

5.强烈建议三个上机重复。有的老师说这个技术这么先进,精度这么高我是不是就不用做上机重复了。其实这个问题您想想平时做qPCR就明白了,qPCR精度也很高咱们为啥要做两个甚至三个复孔呢,排除误差嘛。

6。PRM结果和iTRAQ or Label-Free结果不相符怎么办,不要慌张,这是有可能发生的。你要问我更相信哪一个,当然是PRM!

7.PRM结果好不好,看看标准曲线建的怎么样就知道了,随便秀一两张我们实验室出来的标曲建立图给你当参考:

纵坐标是离子强度,不要问我为啥值那么大,因为我也不知道

8.担心经费不做,做不起PRM绝对定量?没事PRM也可以做相对定量,相对定量除了标曲建立没有之外(不用合成肽段了),其他部分与绝对定量无异,关键是便宜啊,还能发文章。

9。PRM作为一种蛋白验证手段以广泛用于生物学研究中,相关文章一大堆,自己随便Pubmed一下就知道了。

你想看的PRM案例解读


案例一:PRM绝对定量



咋一看题目貌似跟PRM没有半毛钱关系,但是你点进去看就知道了,PRM验证实验可是文章的主要数据结果。我们按套路来简单解读一下这篇文章:

现象:Cells, MVs, EXOs三个不同组分所含有的蛋白的异同(定性蛋白组学)


进一步找差异:TNF 刺激细胞后,Cells, MVs, EXOs三个不同组分所含有的差异蛋白的异同(Label-Free相对定量蛋白组学)


验证:PRM验证其中14个蛋白(PRM绝对定量蛋白组学)

一句话点评:纯蛋白组学技术完全可以撑起一篇文章!

案例二:PRM相对定量

这是中国农大刚发的一篇iTRAQ结合PRM相对定量验证的文章,思路非常简单:


现象:不同品种的猪肉纤维不同

找原因:用iTRAQ相对定量蛋白组技术找差异蛋白进行分析


验证:挑选其中几个关键蛋白进行PRM相对定量进行验证

一句话点评:人家都没上绝对定量,为啥能发,因为实验现象(表型)好啊

总结:本文主要介绍了PRM实验技术(划重点:我们公司能做这个,而且做的很好),然后介绍了两个最新案例(划重点:你要愿意砸钱做蛋白组学,发文章其实不难

 

参考文献

[1]。 Peterson AC1, Russell JD, Bailey DJ, et al。 Parallel reaction monitoring for high resolution and high mass accuracy quantitative, targeted proteomics。 Mol Cell Proteomics。 2012 11(11):1475-88。

[2]. Ronsein GE, Pamir N, von Haller PD, et al. Parallel reaction monitoring (PRM) and selected reaction monitoring (SRM) exhibit comparable linearity, dynamic range and precision for targeted quantitative HDL proteomics. J Proteomics. 2015 15;113:388-99.

[3]. Schilling B, MacLean B, Held JM, et al. Multiplexed, Scheduled, High-Resolution Parallel Reaction Monitoring on a Full Scan QqTOF Instrument with Integrated Data-Dependent and Targeted Mass Spectrometric Workflows. Anal Chem. 2015 20;87(20):10222-9.

[4]. Wang Z, Shang P, Li Q, Wang L, et al. iTRAQ-based proteomic analysis reveals key proteins affecting muscle growth and lipid deposition in pigs. Sci Rep. 2017 24;7:46717.

[5]. Dozio V, Sanchez JC. Characterisation of extracellular vesicle-subsets derived from brain endothelial cells and analysis of their protein cargo modulation after TNF exposure. J Extracell Vesicles. 2017 19;6(1):1302705.





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