重磅消息!美吉转录组又一力作(转自美吉微信公众号)

  • 2017-11-22 10:27:04
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概要:看到青蒿二字,就会联想到诺贝尔医学奖获得者屠呦呦~,还有我们美吉客户在《New Phytologist》期刊上发表的青蒿转录组高分文章!小编搜到文章之后就迫不及待得拜读起来,给大家分享一下这篇文章,或许你能从中汲取一些思路和灵感呢~!

转载地址:


英文题目:The roles of AaMIXTA1 in regulating the initiation of glandular trichomes and cuticle biosynthesis in Artemisia annua


中文题目:AaMIXTA1在调控青蒿腺毛状体发生和角质层生物合成中的作用


期刊:New Phytologist


影响因子:7.33

研究背景

  青蒿叶上的腺分泌毛状体(glandular secretory trichomes ,GSTs)具有分泌和储存青蒿素的能力,青蒿素对并发疟疾是最有效的治疗方法。 因此,增加青蒿中GSTs的密度是提高青蒿素含量的有效策略。然而,GSTs的形成机制仍然知之甚少。


植物材料和生长条件

材料来源:筛选自广泛种植的青蒿品种并在实验室中培养多代,称为huhao1号。
培养环境:温度25±2℃,16小时:8小时(光照:黑暗光周期)生长。


研究结果

1. 参与植物组织发育的AaMIXTA1的鉴定和表征

  使用激光捕获显微切割(LCM)方法分离GSTs,并从中提取用于RNA- seq的总RNA。将GSTs转录组数据与拟南芥MYB蛋白序列进行BLASTP比对分析,鉴定到97个MYB蛋白(图1a)。根据来自其他不同青蒿组织已发表的数据,分析这97个MYB的表达水平,以寻找与已知青蒿素生物合成酶共表达的那些MYBs(9个基因)(图1a)。此外,前人已报道了几种MYB转录因子(尤其是MIXTA  和MIXTA-like基因)参与了其他植物毛状体的发生和发育。


  对鉴定到的9个候选MYBs进行系统发育分析表明,只有一个contig10694与拟南芥毛状体发生和发育中发挥功能的MIXTA-like转录因子AtMYB16和AtMYB106聚类。进一步的分析表明contig10694也与来自其他物种的MIXTA因子聚集(图1b)。因此,将contig10694命名为AaMIXTA1,并作为进一步研究的候选基因。





图1
 
2. AaMIXTA1定位于细胞核内,在青蒿中的GSTs基底细胞中表达显著

  为了进一步研究AaMIXTA1的亚细胞定位,将 mCherry融合至AaMIXTA1的C端。如(图2a)所示,在表皮细胞的细胞核中观察到  mCherry荧光,表明AaMIXTA1定位于细胞核中。通过定量RT-PCR检测AaMIXTA1在青蒿不同组织中的表达,结果表明AaMIXTA1在茎,幼叶,花芽和成熟花中表达,在花芽中表达量最高(图2b)。AaMIXTA1在最小叶龄(叶片0)中的表达高于其他叶片,并随叶龄而快速下降(图2c)。


  为了进一步检测AaMIXTA1的组织特异性表达模式,克隆了AaMIXTA1的2569bp启动子序列。将该片段引入GUS(β-glucuronidase)编码区的上游,并用农杆菌介导的方法将其转化到青蒿中。GUS染色显示AaMIXTA1在青蒿茎尖(图2d,f)以及在叶龄最小的叶片中高表达(图2e)。GUS染色在腺毛中比其他区域强(图2g),主要集中在腺毛的两个基底细胞中(图2h)。通过使用环氧树脂半薄切片的光学显微镜进一步研究顶端分生组织中的GUS活性。在顶端分生组织毛状体的两个基底细胞中清楚地观察到GUS活性(图2i)。这些结果表明,AaMIXTA1主要在青蒿GSTs的基底细胞中表达。




图2
 
3. AaMIXTA1是调控青蒿中GSTs发生的正向转录因子

  为了进一步探讨AaMIXTA1在青蒿中的功能,作者构建了过表达AaMIXTA1的转基因青蒿。定量RT-PCR分析显示,AaMIXTA1在转基因系中的表达显著增加(图3h)。与空载体对照组相比,三个独立的OE-AaMIXTA1系叶片近轴面的GSTs数量增加了1。3-1。5倍(图3a,b,e)。




图3


  利用扫描电镜观察成熟叶片近轴面GSTs和T形非分泌毛状体(T-shaped nonsecretory trichomes,TSTs)的变化。三个转基因株系与对照相比都有明显的GSTs数量增加,并与AaMIXTA1转录水平增加相关(图4a,b)。另外,与对照相比,OE-AaMIXTA1 品系中的青蒿素含量从8mg g-1DW增加到16mg g-1DW(图4j)。相反,使用  RNAi抑制AaMIXTA1表达的品系AaMIXTA1的表达减少41-53%(图3i)。作者发现在这些AaMIXTA1-RNAi品系中GSTs的密度下降26-33%(图3a,c,f),同时青蒿素含量降低到6-6.51 mg g-1 DW(图4k)。

为了进一步分析AaMIXTA1的功能,使用转基因的AaMIXTA1-EAR植物(表达嵌合阻遏物,抑制下游靶基因)用于研究。在AaMIXTA1-EAR转基因植物中AaMIXTA1表达增加(图3j)。GSTs的详细观察表明,AaMIXTA1下游靶基因的抑制显著降低了转基因青蒿成熟叶片近轴面的GSTs密度(图3d,g)。这些结果进一步通过扫描电镜观察证实(图4a,c)。相对于产生8.15 mg g-1 DW的空载体对照,转基因组青蒿素的含量减少到4.69-5.61 mg g-1 DW(图4I)。


  观察相同发育阶段OE-AaMIXTA1或AaMIXTA1-EAR转基因系中成熟的10细胞GSTs结构形态,发现没有影响(图4d-f)。此外,在OE AaMIXTA1 和AaMIXTA1-EAR株系中,基底细胞上具有两个丝状结构的TSTs表型也是正常的(图4a,g-1)。这些结果表明,AaMIXTA1是青蒿中GSTs和TSTs发生的正调控因子。



图4
4. AaMIXTA1促进青蒿角质层沉积

  通过GC-MS分析OE-AaMIXTA1和AaMIXTA1-RNAi转基因株系叶片中蜡和角质单体的积累,并与空载体对照株进行比较。OE-AaMIXTA1叶中的总蜡增加10-40%,特别是主要的角质层蜡,包括二十二烷酸, 蜡酸, 二十六醇和β-香树脂醇(图5a)。而且,OE AaMIXTA1系中成熟叶片表面的总角质单体增加了20-25%(图5b)。在OE-AaMIXTA1系中,单功能棕榈酸等含量显著增加(图5b)。相比之下,AaMIXTA1-RNAi株系总蜡和角质单体的积累显著降低(图5c,d)。 AaMIXTA1-RNAi叶中总蜡减少了c. 50-77%(图5c)。包括山嵛酸,蜡酸,三十二烷,二十六醇,二十八醇和β-香树脂醇的蜡组分的浓度在所有三个独立的转基因品系中显示出明显的降低(图5c)。在AaMIXTA-RNAi品系中,棕榈酸,硬脂酸等含量降低。然而,蜡和角质单体主要组分的含量没有变化(图5b,d)。这表明AaMIXTA1在青蒿中调节角质层的生物合成。




图5


5. AaMIXTA1在青蒿中调节与角质层生物合成有关的基因的表达

  对AaMIXTA1-RNAi-3和空载体对照转基因植株进行RNA-seq,以便更好地理解AaMIXTA1对青蒿角质层生物合成的影响。AaMIXTA1-RNAi和对照植物之间差异表达的基因有2583个 (FDR<0.05,log2 | FC |>1)。在本研究中,侧重于角质层生物合成中涉及的基因,鉴定了37个角质层生物合成相关基因,包括涉及角质层和角质内蜡生物合成以及聚合角质基质生物合成和蜡转运的基因(图6a)。 抑制AaMIXTA1转录水平降低了涉及角质层生物合成的16个基因(包括AaCER1,AaWSD1,  AaPAS2,   AaCER2,  AaCER6,AaCYP77A1,AaCYP86A1和AaABCG12(图6a))的表达。另外,在AaMIXTA1-RNAi植株中,与青蒿素生物合成有关的AaADS,  AaDBR2和AaDXS的表达水平也降低(图6b)。

使用定量RT-PCR进一步验证AaMIXTA1对多种转基因品系中角质层生物合成的具有调控作用。角质和蜡相关合酶基因AaCYP77A1,AaCYP86A1,  AaABCG12,AaKCS5和AaCER1的表达在  AaMIXTA1-RNAi-3和AaMIXTA1-RNAi-7株系中都被证实显著降低(图6c)。在AaMIXTA1 RNAi-3转基因株系中AaADS,AaDBR2和AaDXS的表达也显著降低(图S4)。双荧光素酶报告基因检测实验表明,AaMIXTA1显著激活了AaKCS5,  AaCER1, AaCYP77A1,AaCYP86A1和AaABCG12的表达(图6d)。


  总之,AaMIXTA1上调青蒿角质层的生物合成。




图6

总结

  为了探讨青蒿中GSTs启动机制,作者从GSTs转录组数据中筛选了转录因子MYB(myeloblastosis)基因并鉴定了转录因子MIXTA的成员AaMIXTA1,其主要在青蒿中的GSTs基底细胞中表达。  AaMIXTA1的过度表达和抑制分别导致转基因植物中GSTs数量和青蒿素含量的增加和减少。在后续的实验研究中,作作者还发现AaMIXTA1可以直接激活角质层生物合成相关基因的表达。


  总之,本研究发现青蒿中AaMIXTA1能够调节角质层生物合成并在促进GSTs的发生,因此提供了一个提高该重要药用植物青蒿素含量的新途径。

图7

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